Revista ix

OBTENCIÓN DE PLANTAS A PARTIR DE
ANTERAS DE ESPÁRRAGO
(Asparagus officinalis L.)
MUÑOZ, Sebastián ; ESPÓSITO, María Andrea ; CRAVERO, Vanina ;
GARCÍA, Stella ; LÓPEZ ANIDO, Fernando ; COINTRY, Enrique
Docentes de la Cátedra GenéticaDocentes de la Cátedra de HorticulturaFacultad de Ciencias Agrarias. UNRC.C. Nº 14 (S2125ZAA) Zavalla Santa Fe - ArgentinaE-mail: [email protected] Los híbridos F 1 muestran un rendimiento superior a las poblaciones cultivadas. Su producción es un proceso lento, por lo cual se emplean técnicas biotecnológicas. El cultivo de anteras in vitro produce plantas homocigotas masculinas (MM) y femeninas (mm). El objetivo fue identificar de 15 genotipos élites estaminados aquellos con mayor capacidad de desarrollar plántulas a partir de anteras. Los explantos se sembraron en el medio de Murashige y Skoog (MS), con 2 mg.l de ácido naftalenacético y 1mg.l de bencilamino purina. La incubación se efectuó en cámaras de crecimiento. Se evaluó, la respuesta androgenética (RA) medida como callos desarrollados por anteras sembradas. La regeneración se efectuó sobre el medio MS con 0,1 mg.l de ácido naftalenacético, 0,1 mg.l de cinetina y 0,65 mg.l de ancymidol. Se evaluó la tasa de regeneración (TR), número de vástagos por total de anteras sembradas, y la proporción de plantas enraizadas (TE). En función de RA y TR se efectuó un análisis de agrupamiento y se conformaron cuatro grupos de plantas élites. Se obtuvieron diferencias significativas para RA 1026,9; p<0.001). El 32 % de los callos fueron amarillentos con un comportamiento diferencial de los genotipos ( =402,6; p<0.001), el 49,6 % verde y el resto marrones. Los callos amari- llentos originaron un 29,1 % de plántulas con diferencias entre materiales ( =186,8; p<0.001) y con un porcentaje de enraizamiento del 82.1 %. La eficiencia del método fue 7 % siendo el 40% de las plántulas haploides, lo que permite concluir que pueden derivarse líneas homocigotos diploides.
Palabras clave:
híbridos F1 líneas homocigotos diploides cultivo in vitro
Revista de Investigaciones de la Facultad de Ciencias Agrarias - UNR | Año VI - Nº 9 | 2006 | 039/ 046 IN-VITRO REGENERATION OF
ASPARAGUS ANTHER CULTURE
The F1 's hybrids show a higher yield than traditional populations but the process of their conventional production techniques is slow; that is why biotechnological techniques are used. The in vitro anthers culture produces female (mm) and male homozygous plants (MM). The aim of this work was to identify from a group of 15 elite male genotypes, those with the ability to regenerate plantlets from anthers. The anthers were placed on MS medium supplemented with 2mg.l of ANA and 1mg.l of BAP and transferred to a MSD medium with 0,1mg.l of KIN (Kinetin) and 0,65mg.l of ancymidol for their regeneration. The androgenetic response (AR) was evaluated as the relation between the number of regenerated shoots and the number of anthers placed. The proportion of rooting was also estimated. Statistical analyses using the Shi-square tes for AR were performed, and a cluster's Analysus ti assemble homogeneous genotypes towards a similar AR and RT was done. Four groups with different characteristics were established. Significant 1026,9; p<0.001) were found. 32% of the calli produced were yellow, 49,6% were green and the rest were brown. Only yellow calli regenerated 29,1% of the plantlets, showing significant differences between genotypes ( =186,8; p<0.001). The percentage of rooting was 82,1. The efficiency of the method was 7% for the genotypes 461, 664, 700 and 894. 40% of the regenerated plantlets were haploids, which lets us conclude that diploid lines can be derived from them Key words:
F1 hybrid - diploid lines - in vitro culture.
Revista de Investigaciones de la Facultad de Ciencias Agrarias - UNR | Año VI - Nº 9 | 2006 | 039/ 046 Obtención de plantas a partir de anteras de espárrago (Asparagus officinalis L.) MUÑOZ, Sebastián; ESPÓSITO, María Andrea; CRAVERO, Vanina; GARCÍA, Stella; Introducción
El espárrago (Asparagus officinalis L.) es (Corriols y Thévenin, 1979; Doré, 1990) dependiendo el éxito, de las características Mediterráneo y Asia menor (Meusel et al., del material utilizado como punto de partida.
1965), crece en climas templados y subtropicales y es la única especie de su El desarrollo de híbridos simples F , de gran género cultivada como hortaliza (Ornstrup, explotar de una manera más eficaz la heterosis, siendo necesario contar con líneas Al igual que en otras especies dioicas, las puras. En esta especie la obtención de líneas plantas pistiladas son homogaméticas (XX) y es dificultosa debido a la dioecia de la especie las plantas estaminadas son heterogaméticas por lo que el cultivo in vitro de anteras puede (XY) (Reuther, 1992). La expresión del sexo se ser utilizado como método para la obtención de progenitores de los híbridos F . El éxito de dominante para la masculinidad (Marks, 1979) esta metodología depende tanto del estado fisiológico de plantas donadoras como del heterocigotas (Mm), mientras que las plantas estadío de desarrollo del polen cuando las pistiladas son homocigotas recesivas (mm).
anteras son cultivadas y de la presencia o ausencia de reguladores de crecimiento en el La particular biología de la especie ha permitido desarrollar un gran número de 1977). En condiciones óptimas de las plantas materiales que han sido seleccionados por su donadoras, los niveles de producción de alto rendimiento de acuerdo a las diferentes plantas haploides suelen ser superiores al 1-2 condiciones climáticas y de suelo de las áreas % del total cultivado existiendo diferencias en productoras, y a la demanda local de mercado la respuesta para los distintos genotipos. El cultivo de anteras genera dos tipos de plantas desarrollaron distintos tipos de híbridos de homocigotas viables: plantas estaminadas (MM), que son fenotípicamente iguales a los poblaciones originales, permitiendo explotar machos ordinarios pero su polen es sólo de el fenómeno de heterosis (Cointry et al., 1993) genotipo M y plantas homocigotas femeninas y presentan un rendimiento significativamente superior al de las poblaciones de origen hembras regeneradas por cultivo de anteras es aproximadamente 60 % de machos y 40 % hembras (Falavigna y Sorresi 1983). Cuando Los primeros híbridos comerciales fueron la duplicación de cromosomas de las plantas híbridos dobles con elevada variabilidad haploides no ocurre espontáneamente en el genética desarrollándose con posterioridad estadío de callo, los meristemas haploides híbridos clonales que presentan una mayor homogeneidad al provenir de la hibridación diferentes concentraciones de colchicina por de dos plantas selectas no endocriadas que unos pocos días para permitir su desarrollo fueron clonadas por división de la araña. Sin como plántula diploide (Doré 1976). Dado que embargo, el mejoramiento del espárrago a el espárrago reacciona favorablemente al través de técnicas convencionales resulta un cultivo in vitro, la posibildad de disponer de proceso arduo que requiere muchos años, plantas haploides permitirá acelerar los por lo cual, en las últimos décadas, se han c o m e n z a d o a d e s a r r o l l a r t é c n i c a s El objetivo del presente trabajo fue identificar biotecnológicas como auxiliares en los planes obtención de híbridos clonales entre plantas desarrollar plántulas a partir de anteras.
selectas multiplicadas por cultivo in vitro Materiales y Métodos
Como material experimental se utilizaron de Ciencias Agrarias de la UNR.(Tabla 1).
anteras provenientes de 15 genotipos estaminados de plantas élites progenitoras de Los pimpollos florales se recolectaron durante híbridos clonales producidos por la Facultad los meses de septiembre y octubre, con un Revista de Investigaciones de la Facultad de Ciencias Agrarias - UNR | Año VI - Nº 9 | 2006 | 039/ 046 tamaño de 1,5 a 2 mm (coincidente con el µE.m .s . Se utilizó un diseño completamente estado uninucleado de las microsporas) y se aleatorizado para la distribución de los tubos mantuvieron en heladera durante 24 horas a La respuesta androgenética medida como el La desinfección se efectuó por inmersión en total de callos desarrollados en relación al etanol al 70 % seguido por 5 minutos en una total de anteras sembradas fue evaluada por solución de hipoclorito de sodio al 3 % de medio de la prueba de ji-cuadrado (Sokal y cloro activo con posteriores lavados de agua Rohlf, 1976), Para su regeneración los callos bidestilada estéril. Las anteras (8 explantos fueron transferidos a un medio de cultivo por tubo) fueron cultivadas en tubos de vidrio de 150x10 mm conteniendo 8 ml de medio de Murashige y Skoog (1962) (MS) con 0,1 mg.l efectuaron 20 repeticiones lo que totalizó una de ácido naftalenacético, 0,1 mg.l de cinetina siembra de 160 anteras por cada genotipo.
y 0,65 mg.l de ancymidol y 5% de agar. Se evaluó la tasa de regeneración (TR) medida La iniciación de callos fue realizada sobre el como el número de vástagos desarrollados en relación al total de anteras sembradas, macroelementos, microelementos y vitaminas suplementado con 2 mg.l de ácido naftalen- grupos homogéneos de genotipos en función acético (ANA) y 1 mg.l de bencilaminopurina (BAP). El pH del medio fue ajustado a 5,9.
capacidad de formar callos blanco-amarillentos y verdes y de la TR, se efectuó un análisis de agrupamiento (Joining Tree, durante 6-8 semanas y a una temperatura de STATISTICA) (Stat Soft, 1993). Para el conteo 282°C transfiriéndose luego a cámaras de cromosómico se efectuó el examen citológico crecimiento con a una temperatura de 252°C y un fotoperíodo 16 hs hasta la aparición de desarrolladas según la técnica descripta por callos con una intensidad lumínica de 50 Tabla 1: Porcentaje de callos totales(CT) y embriogénicos (CE), de vástagos y plantas de las
diferentes plantas élites evaluadas
Criterio de Selección
Plantas élites
CT: % callos totales CE: % callos embrionarios Revista de Investigaciones de la Facultad de Ciencias Agrarias - UNR | Año VI - Nº 9 | 2006 | 039/ 046 Obtención de plantas a partir de anteras de espárrago (Asparagus officinalis L.) MUÑOZ, Sebastián; ESPÓSITO, María Andrea; CRAVERO, Vanina; GARCÍA, Stella; Resultados
Luego de 6-8 semanas de cultivo en oscuridad con características diferenciales (Tabla2).
se observó la formación de masas callosas a partir del interior de las anteras. Se observaron Grupo I (G ): formado por aquellos genotipos diferencias altamente significativas en la androgenética y de formación de callos p<0.001) (Tabla1). Luego de su transferencia blanco-amarillentos (embriogénicos), bajo a la luz se observó que algunos callos se porcentaje de callos verdes y los valores más elevados de la tasa de regeneración.
crecimiento moderada; otros marrones con detención de su crecimiento y otros capacidad androgenética intermedia al igual rillento con una alta velocidad de crecimiento. que en la capacidad de formación de callos El 32 % de los callos producidos presentaron embriogénicos y verdes como así también en u n a c o l o r a c i ó n a m a r i l l e n t a c o n u n comportamiento diferencial de los genotipos ( =402.6; p<0.001), el 49,6 % verde y el resto Grupo III (G ): materiales (581 y 693) con capacidad nula de formación de callos embriogénicos y valores nulos de tasa de Sólo los callos amarillentos originaron regeneración pero con máxima capacidad plántulas en una proporción del 29.1 % con diferencias entre los materiales ( =186.8; p < 0 . 0 0 1 ) y c o n u n p o r c e n t a j e d e Grupo IV (G ): plantas élites (207 y 611) con baja capacidad androgenética con formación de callos embriogénicos y valores nulos de El análisis de agrupamiento de los genotipos tasas de regeneración. (Gráfico 1).
permitió la conformación de cuatro conjuntos Tabla 2: Valores promedios correspondientes a los cuatro grupos de genotipos conformados
Variables
Inducción
% Callos embriogénicos
Tasa Regeneración
% Callos Verdes
Gráfico 1: Agrupamiento de plantas donantes de anteras en función de la capacidad de formar
callos blanco-amarillentos o verdes, capacidad de inducción y valores de las tasas de
regeneración
Revista de Investigaciones de la Facultad de Ciencias Agrarias - UNR | Año VI - Nº 9 | 2006 | 039/ 046 Discusión
El cultivo de anteras resultó ser hasta el de formación de callos embriogénicos, baja capacidad de formación de callos verdes, eficaz y accesible para crear plantas doble intermedia capacidad de inducción y valores intermedios de TR. Para el genotipo 461, el 10 necesario abordar dos serias limitaciones: su % de las anteras produjeron callos, de los fuerte dependencia genotípica y el escaso cuales el 5,8 % eran embriogénicos y, a partir del mismo, se obtuvo una sola planta pero sin raíces funcionales. Para el genotipo 664, el 94,1 % de las anteras produjeron callos, de los demostraron que el genotipo influye tanto cuales el 17,8 % eran embriogénicos y se sobre la inducción de androgenesis, sobre la tendencia a iniciar callo, como así también sobre la capacidad del callo en regenerar vástagos y en su habilidad para establecer la Es un prerrequisito esencial la presencia de corona. Estas afirmaciones concuerdan con una corona funcional para transferir las nuestros resultados ya que se observó que la r e s p u e s t a a n d r o g e n é t i c a , d e p e n d e autotróficas con éxito. El ancymidol reduce el tiempo necesario para producir plántulas. genotipos no produjeron callos mientras otros Yang y Clore (1973) lograron tener plántulas lo hicieron con valores de 94 % a partir de las repicables en 20 semanas utilizando un medio anteras sembradas. Tsay y Hsu (1986) y Quiao de cultivo sin ancymidol. Chin (1982) logró y Falavigna (1990) observaron también que r e d u c i r e s e p e r í o d o a 8 s e m a n a s incorporando ancymidol al medio de cultivo, fluctuaban entre 0 % y 93 % de las anteras logrando asimismo el desarrollo de tallos y sembradas mientras entre el 1 y 31 % de los formación de callos. En este trabajo, se obtuvieron vástagos en condiciones de ser Debido al hecho de existir genotipos con buenas aptitudes, el análisis de agrupamiento en función de la respuesta androgenética permitió conformar cuatro grupos de los que el grupo 1 (genotipos 700 y 894) demostró ser La eficiencia del cultivo de anteras obtenida superior. El genotipo 700 permitió que el 39 % fue del 2 % del total de anteras sembradas, de las anteras produjeran callos, de los cuales sembrados. Y se obtuvo una eficiencia del 7 % resultados fueron similares a los presentados cuando se tuvieron en cuenta los resultados por Wolyn y Feng (1993), quienes obtuvieron arrojados por los genotipos 461, 664, 700 Y un 45 % de callos, de los cuales el 30 % eran 894, los cuales formaron parte de los dos embriogénicos. Sin embargo, Rotondo (1984) grupos que respondieron de mejor manera. y Hsu et al. (1988) observaron que menos del Falavigna et al. (1990) obtuvieron menos de 10 plantas por cada 100 anteras cultivadas y A partir del genotipo 700 lograron obtenerse Los resultados del conteo cromosómico en 11 plantas, de las cuales el 81,8 % tuvieron ápices radiculares de plantas tomadas al azar porcentaje de haploidía y diploidía del 40 % y produjeron callos y el 40,5 % de ellos fueron 60 %, respectivamente. El hecho de que el embriogénicos. A partir de este genotipo se obtuvieron 21 plantas, de las cuales el 95,2 % significa que el desarrollo del callo no haya sido a partir de microsporas haploides. Las plantas diploides obtenidas pueden haber El grupo 2 (genotipos 461 y 664) presentó provenido de la duplicación cromosómica espontánea de las plantas haploides en la fase también interesantes para los fines de este de callo (Doré, 1976). Para comprobar esta situación, deberían realizarse pruebas a caracterizaron por su capacidad intermedia Revista de Investigaciones de la Facultad de Ciencias Agrarias - UNR | Año VI - Nº 9 | 2006 | 039/ 046 Obtención de plantas a partir de anteras de espárrago (Asparagus officinalis L.) MUÑOZ, Sebastián; ESPÓSITO, María Andrea; CRAVERO, Vanina; GARCÍA, Stella; pistiladas, implicaría automáticamente que la cultivo in vitro de anteras, es posible obtener planta provino de microsporas y se duplicó plantas haploides y dihaploides que pueden durante el cultivo in vitro. Si apareciesen ser utilizadas para la producción de híbridos, observar su descendencia al cruzadas con plantas pistiladas. Si la descendencia fuera toda estaminada, implicaría que la planta diploide es homocigótica, mientras que si la Aunque el logro de homocigosidad rápida descendencia estuviera constituida por 50% seguirá siendo la ventaja principal del cultivo de plantas estaminadas y 50% pistiladas, sería de anteras, la homogeneidad y la estabilidad indicativo de que la planta se desarrolló a de los haploides duplicados permitirán a los partir de la pared de la antera manteniendo el mejoradores hacer selecciones más efectivas, especialmente respecto a caracteres que experimentan intensamente el influjo del Esto nos permite concluir que mediante el Bibliografía
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Source: http://www.cienciasagronomicas.unr.edu.ar/revista/articulos/RIFCA-2006_a6(09)039-046.pdf