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Departement für Nutztiere Vetsuisse-Fakultät Arbeit unter der Leitung von Dr. F. Janett Einfluss der Zentrifugationsmethode auf Qualität und
Kryokonservierung von Hengstsamen
Simone Weiss
Einfluss der Zentrifugationsmethode auf Qualität und Kryokonservierung
von Hengstsamen
S. Weiss1, F. Janett2, D. Burger1, M. Hässig2, R. Thun2 1Nationalgestüt, Avenches, 2Klinik für Fortpflanzungsmedizin der Universität Zürich Zusammenfassung
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss von verschiedenen Zentrifugationsmethoden auf Spermienverlust und Gefriersamenqualität abzuklären. Dazu wurden je drei Ejakulate von 8 gekörten Warmbluthengsten des Nationalgestüts Avenches gewonnen, und zur Entfernung des Seminalplasmas nach drei verschiedenen Methoden zentrifugiert. Bei Methode I (Referenzmethode) erfolgte die Zentrifugation bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 600 x g während 10 Minuten. Bei Methode II wurde bei 1000 x g während 2 Minuten und bei Methode III bei 2000 x g während 2 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden jeweils 90% des Überstandes abpipettiert und darin die Anzahl Samenzellen (Spermienverlust) bestimmt. Nach Resuspension mit Gefrierverdünner erfolgte die Bestimmung der funktionellen Membranintegrität mittels HOS-Test sowie die Beurteilung der Motilität. Im aufgetauten Samen prüften wir die Motilität, die Vitalität (SYBR-14/PI), die funktionelle Membranintegrität (HOS-Test) und den Akrosomstatus mit dem Chlortetracyclinassay (CTA). Unsere Ergebnisse zeigen, dass der durchschnittliche Spermienverlust (I, 1.9%; II, 8.7%; III, 3.7%) bei allen drei Zentrifugationsmethoden signifikant (P < 0.05) verschieden war. Bei den Samenqualitätsparametern im aufgetauten Samen konnten wir nur im HOS-Test bei Methode III (52.1%) signifikant schlechtere Werte als bei den Methoden I (55.5%) und II (55.3%) feststellen. Der zur Bestimmung des Akrosomstatus durchgeführte CTA zeigte, dass bei allen drei Methoden im aufgetauten Samen mehr als 70% der Spermien kapazitiert und rund 25 % kapazitiert und akrosomreagiert waren. Aufgrund unserer Ergebnisse kann gefolgert werden, dass sowohl der Spermienverlust wie auch die funktionelle Membranintegrität (HOS-Test) im aufgetauten Samen von der Zentrifugationsmethode signifikant beeinflusst wird. Deshalb soll der Hengstsamen vor der Kryokonservierung bei 600 x g während 10 Minuten zentrifugiert werden, da mit dieser Methode der Spermienverlust am geringsten und die Samenqualität nach dem Auftauen am Schlüsselwörter: Hengst, Kryokonservierung, Samenqualität, Zentrifugation
The influence of centrifugation on quality and freezability of stallion semen
The aim of the present study was to investigate the influence of various centrifugation methods on sperm loss and quality of frozen-thawed semen. From at a total of 8 Warmblood stallions of the National Stud Farm in Avenches, 3 ejaculates each were collected and seminal plasma was removed using 3 different centrifugation regimes. In method I (reference method) centrifugation occurred by a speed of 600 x g during 10 minutes. In method II 1000 x g was used during 2 minutes while in method III centrifugation was performed by 2000 x g during 2 minutes. After centrifugation 90%, of the supernatant was removed and sperm loss calculated. After resuspension of the pellet with freezing medium, functional membrane integrity was evaluated by HOS-test and motility determined. In frozen-thawed semen motility, viability as well as functional membrane integrity (HOS-test) and acrosome status using chlortetracyclinassay (CTA) were assessed. Our results demonstrate that mean sperm loss (I, 1.9%; II, 8.7%; III, 3.7%) was significantly (P < 0.05) different between the three centrifugation regimes. Regarding semen quality of frozen-thawed semen, HOS in method III (52.1%) was significantly lower than in methods I (55.5%) and II (55.3%). Evaluation of the acrosome status by CTA showed that more than 70% of sperm cells were capacitated and 25% capacitated and acrosome reacted. From our results we conclude that sperm loss and functional membrane integrity (HOS-test) in frozen-thawed semen were significantly influenced by the centrifugation regime. Therefore, stallion semen should be centrifuged at 600 x g during 10 minutes before freezing in order to obtain low sperm loss and a good Key words: stallion, cryopreservation, semen quality, centrifugation
Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Einleitung
Die Bedeutung der künstlichen Besamung (KB) in der Pferdezucht hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Vor allem die lange Haltbarkeit und gute Transportmöglichkeit des Gefriersamens steigerten das Interesse der Züchterschaft an dieser Technik. Ein zusätzlicher Vorteil von tiefgefrorenem Samen liegt darin, dass er für die Zucht auch nach dem Tod des Hengstes verfügbar bleibt. Dies sind Gründe weshalb heute immer mehr Stuten, besonders solche aus dem Sport, künstlich besamt werden. In der Schweiz macht die künstliche Besamung mit Gefriersamen bereits 20% aller Belegungen bei Warmblutstuten aus und die Tendenz, Gefriersamen von Leistungshengsten aus dem Sport zu verwenden, nimmt stetig zu. Die trainings- und wettkampfbedingte Abwesenheit dieser Hengste von der Station schränkt die Bereitstellung von Frisch- und Kühlsamen während der Zuchtsaison stark ein. Deshalb wird die Produktion von Gefriersamen immer öfters während der sportfreien Wintermonate angestrebt. Als Nachteile der KB mit Tiefgefriersamen müssen im Vergleich zur Frischsamenübertragung der höherer Arbeitsaufwand hinsichtlich Samenproduktion und Stutenmanagement sowie eine geringere Trächtigkeitsrate in Kauf genommen werden. Als Ursache für die schlechtere Fruchtbarkeit werden vor allem die bei der Samenverarbeitung hervorgerufenen Membranschädigungen angenommen, welche die Vitalität und Befruchtungsfähigkeit der Spermien deutlich mindern (Blach et al., 1988; Watson, 2000). Dies hat zur Folge dass im Vergleich zu Kühl- oder Frischsamen die Trächtigkeitsrate pro Zyklus geringer ist (30-40% vs. 50%) und die Stuten deshalb oft mehrmals besamt werden müssen. Unter günstigen Bedingungen, wie gute Samenqualität nach dem Auftauen sowie eine geschlechtsgesunde Stute und ein optimaler Beamungszeitpunkt, können aber mit Gefriersamen am Ende der Zuchtsaison ebenfalls Trächtigkeitsraten von mehr als 80% Aufgrund der grossen individuellen Variabilität der Samenqualität produzieren nur etwa 25% alle Zuchthengste Samen, der nach Gefrieren und Auftauen zu ähnlichen Trächtigkeitsraten pro Saison führt wie nach Frischsamenbelegungen (Amann und Pickett, 1987). Einige Autoren (Amann und Pickett,1987; Samper et al., 1994) berichten sogar, dass sich gewisse Hengste unabhängig von der Qualität des Frischsamens für den Gefrierprozess besser eignen (good freezers) als andere (poor freezers). Als weitere Einflussfaktoren auf die Kryokonservierbarkeit gelten Dichte und Motilität im Frischsamen (Samper et al., 1994), die Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Samenkonfektionierung, die Einfriergeschwindigkeit sowie Dauer und Temperatur beim Auftauen (Cochran et al., 1984; Blach et al., 1989; Pickett et al., 1993; Borg et al., 1997). Hengstsamen wird vor der Kryokonservierung routinemässig zur Entfernung des Seminalplasmas zentrifugiert. Damit werden mögliche negative Effekte des Seminalplasmas auf die Spermien während des Tiefgefrierens gemindert (Corteel, 1980; Jasko et al., 1991; Samper und Morris, 1998). Jasko et al. (1991) zeigten, dass trotz Entfernung des Seminalplasmas die Motilität der Spermien erhalten blieb. Als Nachteile der Zentrifugation sind jedoch Spermienverlust und Samenzellschädigungen zu nennen, die sowohl von der Zentrifugationszeit wie auch der Zentrifugationsstärke abhängen. Da kontrollierte Studien über die Nachteile der Zentrifugation von Hengstsamen fehlen, bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit darin, den Einfluss von drei verschiedenen Zentrifugationsmethoden auf Spermienverlust und Gefriersamenqualität genauer abzuklären. Tiere, Material und Methoden
Für die vorliegenden Untersuchungen standen 8 in der Schweiz gekörte Warmbluthengste des Nationalgestüts Avenches zur Verfügung. Die Hengste waren zwischen 8 und 21 Jahre alt und wurden während des ganzen Jahres auf dem Gestüt gehalten. Die Fütterung bestand aus Heu (zweimal täglich 3 kg), Hafer (dreimal täglich 1-2 Liter) sowie Pellets (täglich 1-2 Liter) und einmal pro Woche Mash. Wasser stand ad libitum zur Verfügung. Die Hengste wurden täglich bewegt oder konnten auf die Weide. Während der Decksaison (März bis Juni) standen die Hengste im Zuchteinsatz. Vor Versuchsbeginn wurden die extragonadalen Spermienreserven durch Samenentnahmen an fünf aufeinanderfolgenden Tagen minimiert und alle an das Phantom gewöhnt. Während des Versuchs wurden die Hengste jeweils am Montag, Mittwoch und Freitag abgesamt und insgesamt 24 Ejakulate untersucht und Untersuchungen im Frischsamen
Unmittelbar nach der Samengewinnung wurde die gelfreie Fraktion des Ejakulates ins Wasserbad (37°C) gestellt, das Volumen in einem Messzylinder abgelesen und die Spermienkonzentration mit einer modifizierten Zählkammer nach Neubauer gemäss Richtlinien der WHO (WHO-Laborhandbuch, 1999) überprüft. Anschliessend wurde das Ejakulat mit INRA 82-Hepes + 2% Eigelb auf 100 Mio. Spermien/ml verdünnt. Die Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Bestimmung der progressiven Motilität erfolgte mit einem Mika Motion Analyzer (Cell Motion Analyzer SM-CMA-1074, MTM, Montreux). Dazu wurden 3 Tropfen à 6 µl des verdünnten Ejakulates auf einen erwärmten (37°C) Objektträger gegeben, mit Deckgläsern (24 mm x 24 mm) versehen und je 4 Felder pro Tropfen ausgewertet. Dies ergab 12 Messungen, wobei jeweils mindestens 500 Spermien beurteilt wurden. Zentrifugation
Der verdünnte Samen wurde bei Raumtemperatur in drei gleiche Aliquote aufgeteilt, in 50 ml Zentrifugenröhrchen gegeben und nach drei verschiedenen Methoden bei freiem Auslauf zentrifugiert (Hermle Zentrifuge ZK 380, E. Renggli AG, Rotkreuz, Winkelrotor 6 x 50 ml, Radius 10.5 cm). Als Methode I (Referenzmethode) wurde das französiche Verfahren (Vidament et al., 2001) gewählt. Dabei wurde das verdünnte Ejakulat bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 600 x g während 10 Minuten zentrifugiert. Bei Methoden II wurde bei 1000 x g während 2 Minuten und bei Methode III bei 2000 x g während 2 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden jeweils 90% des Überstandes abpipettiert und darin die Spermiendichte bestimmt. Das Produkt aus Volumen und Dichte im Überstand wurde als Spermienverlust definiert. Das Spermienpellet wurde mit dem Gefrierverdünner (INRA 82-Hepes + 2% Eigelb + 2.5% Glycerin) auf 100 Millionen Spermien/ml resuspendiert. Anschliessend wurde zur Ermittlung der funktionellen Membranintegrität der HOS-Test (Jeyendran et al., 1984; Neild et al., 2000) durchgeführt und die progressive HOS-Test
Zur Durchführung des HOS-Tests wurden 1 ml HOS-Lösung (Lactose 50 mmol/l) und 100 µl Ejakulat während 30 Minuten bei 37°C inkubiert (Neild et al., 2000) und davon ein 5 µl grosser Tropfen auf einen Objektträger gegeben, mit einem Deckglas (24 mm x 24 mm) versehen und bei 400facher Vergrösserung im Phasenkontrastmikroskop insgesamt 200 Spermien beurteilt. Aufgrund der morphologischen Veränderungen des Spermienschwanzes konnte der prozentuale Anteil geschwollener Spermien (HOS-positiv) bestimmt werden. Samentiefgefrierung
Die Kühlung des Samens auf 4°C erfolgte während einer Stunde in der Kühlvitrine auf einem Mischgerät (Rock’n Roller, Minitüb, Landshut, Deutschland). Anschliessend fanden die Konfektionierung in 0.5 ml Pailletten (MRS1 Cassou, IMV, Aigle, Frankreich) sowie die Samentiefgefrierung (Minidigitcool 700 ZB 290, IMV, Aigle, Frankreich) mit einer Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Abkühlgeschwindigkeit von 60°C/Min. von +4°C bis -100°C und 30°C/Min. von -100°C bis - 140°C statt. Die tiefgefrorenen Pailletten wurden im Flüssigstickstoff bei –196°C gelagert. Untersuchungen im aufgetauten Samen
An der Klinik für Fortpflanzungsmedizin wurden von jedem Ejakulat jeweils zwei Pailletten im Wasserbad bei 37°C während 30 Sekunden aufgetaut und zusammengegeben. Im aufgetauten Samen wurden der HOS-Test, die progressive Motilität sowie die Vitalität (strukturelle Membranintegrität) und der Akrosomstatus bestimmt. Vitalität
Zur Bestimmung der Vitalität wurde eine DNA-Doppelfärbung durchgeführt (LIVE/DEAD Sperm Viability Kit, Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande). Der Fluoreszenzfarbstoff SYBR-14 zeigt eine hohe Affinität zur DNA lebender und toter Zellen, während Propidiumjodid (PI) nur die Zellmembran toter Zellen zu durchdringen vermag (Garner et al., 1994). SYBR-14 (Komponente A) wurde mit DMSO 100% in einem Verhältnis von 1:10 verdünnt (Komponente AL). Propidiumjodid (Komponente B) wurde in der Form verwendet, wie sie von der Firma geliefert wird. Zu 500 µl aufgetautem, auf 37°C gewärmtem Samen wurde 1 µl der Komponente B zugegeben und während 3 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach 3 Minuten wurde 1 µl der Komponente AL dazugegeben und während einer weiteren Minute bei 37°C inkubiert. Dann wurden 5 µl des gefärbten Samens auf einen Objektträger pipettiert, mit einem Deckglas (24 mm x 24 mm) versehen und bei 400facher Vergrösserung unter dem Mikroskop (Olympus BX50 U Plan Apo 40x0.85 mit Fluoreszenzeinrichtung, U-MWIB-Filtermodul, Hochdruck-Hg-Lampe) betrachtet. Über eine am Mikroskop angeschlossene Videokamera (Color CCD Camera, SANYO VCC-2972) konnten die emittierten Fluoreszenzen auf einen SONY Trinitron Video Monitor (PVM-1440 QM) projiziert und 200 Spermien ausgezählt werden. Akrosomstatus
Die Bestimmung des Akrosomstatus erfolgte mittels Chlortetracyclinassay (CTA). Dabei können je nach Fluoreszenzmuster des Spermienkopfes nicht kapazitierte von kapazitierten akrosomintakten und akrosomreagierten Spermien unterschieden werden. Nicht kapazitierte, akrosomintakte Spermien (CTC-F) zeigen eine uniforme Fluoreszenz über den ganzen Spermienkopf, kapazitierte, akrosomintakte Spermien (CTC-B) sind durch ein fluoreszierendes Akrosom und eine fehlende Fluoreszenz im postakrosomalen Bereich gekennzeichnet. Kapazitierte, akrosomreagierte Spermien (CTC-AR) zeigen hingegen keine Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Fluoreszenz im Akrosombereich, können aber in der postakrosomalen Region fluoreszieren (Wang et al., 1995; Maxwell und Johnson, 1997; Hewitt und England, 1998; Parker et al., 2000; Rathi et al., 2001; Schembri et al., 2002). Die Reagenzien für den CTA wurden gemäss Angaben von Maxwell und Johnson (1997) hergestellt. Zu 20µl Samen, der auf 37°C erwärmt war, wurden 20 µl CTC-Lösung hinzugegeben und gemischt. Dazu kamen 5 µl Fixier-Lösung und 50 µl DABCO-Lösung. Die Komponenten müssen strikt im Dunkeln zusammen gegeben und gemischt werden. Ein 2 µl grosser Tropfen wurde auf einen Objektträger gegeben und mit einem 24 x 24 mm Deckglas versehen. Unter dem Mikroskop (Olympus BX50 U Plan Fl 100x/1.30 Oil Ph3 mit Fluoreszenzeinrichtung, U-MSWB-Filtermodul, Hochdruck-Hg- Lampe) wurden bei 1000facher Vergrösserung 200 Spermien ausgewertet. Statistik
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm StatView 5.0 (SAS Institut, Dübendorf). Der Einfluss der Zentrifugationsmethode und des Hengstes auf den Spermienverlust und die Samenqualitätsparameter wurden mit einer multivariaten Varianzanalyse geprüft. Die graphische Darstellung der Parameter erfolgte mit Boxplots. Zur Berechnung der Unterschiede zwischen den Zentrifugationsmethoden wurden die Ergebnisse dem Fisher’s PLSD post hoc Test unterzogen. Die Signifikanzschwelle wurde auf 0.05 Ergebnisse
Die Ergebnisse über den Einfluss der Zentrifugationsmethode sowie des Hengstes auf den Spermienverlust und die Gefriersamenqualität sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Daraus ist klar ersichtlich, dass die Zentrifugationsmethode einen signifikanten (P < 0.05) Einfluss sowohl auf Spermienverlust und funktionelle Membranintegrität (HOS-positiv) bei aufgetauten Samenzellen hatte. Der Hengst zeigte einen signifikanten (P < 0.05) Einfluss auf die Motilität, den HOS-Test sowie auf die Vitalität im aufgetauten Samen. Die Unterschiede des Spermienverlustes und der Samenqualitätsparameter zwischen den einzelnen Zentrifugationsmethoden sind in Tabelle 2 angegeben. Deutlich zeigt sich, dass der durchschnittliche Spermienverlust an Samenzellen zwischen den drei Zentrifugationsmethoden signifikant (P < 0.05) verschieden war. Am geringsten war der Verlust bei Methode I (1.9%) und am höchsten bei Methode II (8.7%). Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Tabelle 1: Einfluss von Hengst, Zentrifugationsmethode sowie Interaktion Hengst x Zentrifugationsmethode auf Spermienverlust und Samenqualität. Parameter Hengst
Interaktion
Tabelle 2: Spermienverlust und Samenqualität ( ± s) von je 24 Ejakulaten bei 3 verschiedenen Zentrifugationsmethoden (I: 600 x g, 10 Min.; II: 1000 x g, 2 Min.; III: 2000 x g, 2 Min.). Parameter Methode
Methode II
Methode III
a,b,cWerte mit unterschiedlichen Indizes sind signifikant verschieden (P < 0.05) Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Die minimalen bzw. maximalen Spermienverluste gehen aus Abbildung 1 hervor und schwankten bei Methode I von 0.3 bis 7.2%, bei Methode II von 2.1 bis 21.3% und bei Abbildung 1: Boxplot-Darstellung des Spermienverlustes von je 24 Ejakulaten bei 3 verschiedenen Zentrifugationsmethoden (I: 600 x g, 10 Min.; II: 1000 x g, 2 Min.; III: 2000 x g, 2 Min.). Beim HOS-Test im aufgetauten Samen zeigte Methode III signifikant weniger HOS-postive Spermien als Methoden I und II. Der minimale und maximale Anteil an HOS-positiven Spermien bewegte sich bei Methode I zwischen 33.5 und 70.5%, bei Methode II zwischen 38.0 und 69.5% und bei Methode III zwischen 30.0 und 63.0% (Abb. 2). Abbildung 2: Boxplot-Darstellung der HOS-positiven Spermien im aufgetauten Samen von je 24 Ejakulaten bei 3 verschiedenen Zentrifugationsmethoden (I: 600 x g, 10 Min.; II: 1000 x g, 2 Min.; III: 2000 x g, 2 Min.). Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Diskussion
Vor dem Tiefgefrieren von Hengstsamen ist die Zentrifugation ein routinemässig durchgeführter Schritt. Mit der teilweisen Enfernung des Seminalplasmas soll dessen schädigender Einfluss auf die Spermien während der Kryokonservierung gemindert und die Spermiendichte nach Resuspension des Pellets erhöht werden. Als Nachteile der Zentrifugation müssen Spermienverluste und Membranschädigungen der Samenzellen genannt werden, was die Vitalität und Befruchtungsfähigkeit der Spermien stark beeinträchtigen kann (Blach et al., 1989; Watson, 2000). Um das Ausmass dieser negativen Auswirkungen abzuklären, wurden in der vorliegenden Studie drei verschiedene Zentrifugationsmethoden miteinander verglichen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl der Spermienverlust wie auch die funktionelle Membranintegrität (HOS-Test) im aufgetauten Samen von der Zentrifugationsmethode signifikant beeinflusst werden. Bei Methode I, die in Frankreich entwickelt wurde und heute weit verbreitet zur Anwendung kommt, wird bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 600 x g während 10 Minuten zentrifugiert. Ein Vergleich zu den Methoden II (1000 x g, 2 Min.) und III (2000 x g, 2 Min.) zeigt, dass bei einer Erhöhung der g-Zahl mit gleichzeitiger Reduktion der Zentrifugationsdauer auf 2 Minuten der Spermienverlust deutlich erhöht wird. Da der Verlust bei Methode II (8.7%) verglichen mit den Methoden I (1.9%) und III (3.7%) am höchsten war, kann gefolgert werden, dass bei einer Zentrifugationsdauer von 2 Minuten die g-Zahl über 2000 erhöht werden muss, um den Spermienverlust gering zu halten. In diesem Zusammenhang muss jedoch berücksichtigt werden, dass mit einer Erhöhung der Zentrifugalbeschleunigung auch die Membranschädigungen (HOS-Test) der Samenzellen nach dem Auftauen signifikant ansteigen. Nach Aitken und Clarkson (1988) sollen die nach der Zentrifugation menschlicher Ejakulate beobachteten Membranschädigungen irreversibel und auf sogenannte „reactive oxigen species“ (ROS) zurückzuführen sein. Dabei soll die Zentrifugationszeit eine grössere Rolle spielen als die Zentrifugalbeschleunigung (Shekarriz et al., 1995). Angaben aus der Literatur zeigen, dass nach der Zentrifugation von Ejakulaten bezüglich Spermienverlust und Spermienschädigung tierartliche Unterschiede bestehen. So haben Carvajal et al. (2001) gezeigt, dass nach Zentrifugation von Eberejakulaten bei 2400 x g während 3 Minuten die Vitalität und in vitro Penetration homologer Oozyten der aufgetauten Spermien besser waren als bei 800 x g während 10 Minuten (Referenzmethode, Westendorf et al., 1975). Allerdings wurde bei Anwendung der Referenzmethode beim Eber ein Spermienverlust zwischen 19 und 25% (Erikson et al., 2002) gefunden, was im Vergleich zu Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Hengstsamen (1.9%) bei einer Zentrifugalbeschleunigung von 600 x g während 10 Minuten deutlich höher ist. Anders als beim Eber, aber ähnlich wie beim Hengst wird bei der Konservierung von Rüdensamen eine Zentrifugation bei 720 x g während 5 Minuten empfohlen. Mit dieser Methode betrug der Spermienverlust nur 2.3% und die Vitalität der konservierten Spermien war deutlich besser als bei höheren g-Zahlen (Rijsselaere et al., In unseren Untersuchungen haben wir neben der Beurteilung der funktionellen Membranintegrität mittels HOS auch den Akrosomstatus mit Hilfe des Chlortetracylinassays (CTA) genauer abgeklärt. Das in diesem Test eingesetzte Chlortetracylin besitzt die Eigenschaft nach Bindung mit freien Kalzium-Ionen zu fluoreszieren. Da die intrazelluläre Zunahme freier Kalzium-Ionen zur Auslösung von Kapazitation- und Akrosomreaktion von entscheidender Bedeutung ist, können mit dem CTA nicht kapazitierte von kapazitierten akrosomintakten und akrosomreagierten Spermien unterschieden werden. Der CTA wurde schon früher bei verschiedenen Spezies wie Maus (Sailing und Storey, 1979), Schwein (Wang et al., 1995), Rind (Fraser et al., 1995), Schaf (Gillan et al., 1997), Ziege (Kaul et al., 1997), Pferd (Varner et al., 1987; Rathi et al., 2001; Schembri et al., 2002), Hund (Hewitt und England, 1998) und auch beim Menschen (Lee et al., 1987) erfolgreich angewendet. Nach Vergleich aller drei Zentrifugationsmethoden konnten wir keine signifikanten Unterschiede im Akrosomstatus feststellen. Unerwartet war für uns die Beobachtung, dass im aufgetauten Samen bei allen drei Methoden mindestens 70% der Spermien kapazitiert und rund 25 % kapazitiert und akrosomreagiert waren. Dieses Ergebnis deckt sich mit demjenigen von Schembri et al. (2002), die rund 65% kapazitierte und über 30 % akrosomreagierte Spermien im aufgetauten Hengstsamen fanden. Diese Autoren zeigten ausserdem, dass im Frischsamen mehr als 90% nicht kapazitierte Spermien vorhanden waren und dass die nach Kryokonservierung beobachteten Akrosomveränderungen hauptsächlich auf die Entfernung des Seminalplasmas und anschliessende Resuspension des Pellets mit Verdünner zurückzuführen waren. Der erhöhte Anteil an kapazitierten und akrosomreagierten Spermien nach Zentrifugation könnte ein weiterer Grund für die reduzierte Fruchtbarkeit nach Gefriersamenübertragung sein. Bei der Produktion von Tiefgefriersperma sollte deshalb nicht der ganze Ejakulatüberstand entfernt werden, doch ist nicht genau bekannt welche Restmenge Seminalplasma im Gefriermedium verbleiben sollte. Nach Amann und Pickett (1987) wird empfohlen nach der Zentrifugation rund 90% des Überstandes zu verwerfen. Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Wie schon aus früheren Untersuchungen (Janett et al., 2000, 2003a, 2003b) bekannt ist, konnten wir auch in dieser Studie einen signifikanten Einfluss des Hengstes auf Motilität, HOS und Vitalität des aufgetauten Samens nachweisen. Eine Interaktion von Hengst und Zentrifugationsmethode war jedoch nicht vorhanden. Dies zeigt einmal mehr, dass bei der Gefriersamenproduktion der Hengst die grösste Variable darstellt. Zusammenfassend erlauben unsere Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass bei der Kryokonservierung von Hengstsamen die Zentrifugation bei 600 x g während 10 Minuten hinsichtlich Spermienverlust und Qualität des aufgetauten Samens den grössten Erfolg An dieser Stelle möchte ich folgenden Personen speziell danken: Dr. P. A. Poncet, Direktor des Nationalgestüts Avenches, für die Bereitstellung der Hengste Dr. D. Burger, Leiter des Reproduktionszentrums, Nationalgestüt Avenches, für die Organisation der Hengste und die Koordination der Arbeiten. Prof. Dr. R. Thun, Klinik für Fortpflanzungsmedizin der Universität Zürich, für die Dr. F. Janett, Klinik für Fortpflanzungsmedizin der Universität Zürich, für die Hans Schwab, Leiter des Labors, Nationalgestüt Avenches, für seine tatkräftige Unterstützung Caroline Schwab für die Mithilfe im Labor. Werner Schwab und Jean-Pierre Duc, Nationalgestüt Avenches, für das Management der Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Literatur
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Simone Weiss, Haras National, Clinique, CH-1580 Avenches E-mail: [email protected] Einfluss der Zentrifugationsmethode auf die Kryokonservierung von Hengstsamen ___________________________________________________________________________ Lebenslauf
Primarschule, Sekundarschule, Wädenswil Mathematisch-naturwissenschaftliches Gymnasium Rämibühl, Studium der Veterinärmedizin, Universität Zürich, Schweiz Praktikum am Department of Reproduction, University of Abschlussprüfung an der Veterinärmedizinischen Fakultät der Tierärztin am Nationalgestüt in Avenches

Source: http://www.equimed.ch/files/files/Dissertation_Simone_Weiss.pdf