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Ra Ximhai
Revista de Sociedad, Cultura y Desarrollo Ra Ximhai Universidad Autónoma Indígena de México ISSN: 1665-0441 México EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN (Anthurium andraeanum Lind.) VARIEDAD
‘LAMBADA’
Nydia del Rivero Bautista, Daniel Agramonte Peñalver, Raúl Barbón Rodríguez, Wilder Camacho Chiu, Raúl Collado López, Felipe Jiménez Terry, Marta Pérez Peralta y Odalys Ra Ximhai, enero-abril, año/Vol.4, Número 1 Universidad Autónoma Indígena de México Mochicahui, El Fuerte, Sinaloa. pp. 135-149 Ra Ximhai Vol. 4. Número 1, enero – abril 2008, pp. 135-149. EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN (Anthurium andraeanum Lind.) VARIEDAD
‘LAMBADA’
SOMATIC EMBRYOGENESIS IN (Anthurium andraeanum Lind.) VARIETY
‘LAMBADA’
Nydia del Rivero-Bautista1, Daniel Agramonte-Peñalver2, Raúl Barbón-Rodríguez2,
Wilder Camacho-Chiu3, Raúl Collado-López2, Felipe Jiménez-Terry2, Marta Pérez-
Peralta2 y Odalys Gutiérrez-Martínez2
1Colegio de Postgraduados Campus-Tabasco. Periférico Carlos A. Molina s/n. H. Cárdenas, Tabasco. CP 86500. Fax: (973) 3722297 *Autor para correspondência E-mail: [email protected]; 2Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. CP 54830. Fax: 53(42)281329. E-mail: [email protected] 3Dirección General Tecnológica Agropecuaria. Carretera Cumuapa, Cunduacán, Tabasco, México. E-mail: [email protected] Varias concentraciones y tipos de reguladores de crecimiento fueron probados para inducir
la embriogénesis somática indirecta en Anthurium andraeanum Lind. (Monocotiledónea).
Para la formación de callos, se utilizaron como explantes segmentos foliares de plantas
micropropagadas sobre un medio de cultivo MS modificado suplementado con 6,79 µM de
ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y 2,32 µM kin (kinetina). La diferenciación de los
embriones somáticos se logró en el medio de cultivo MS modificado que contenía 4,44 µM
de 6-bencilaminopurina (6-BAP), en condiciones de oscuridad. La germinación de los
embriones somáticos se obtuvo en el mismo medio de cultivo probado, suplementado con
1,78 µM de 6-BAP cuando se colocaron en una cámara de crecimiento con luz solar.
Palabras clave: Embriones somáticos, medios de cultivo, reguladores de crecimiento.
Several concentrations and types of growth regulators were tested to induce the indirect
somatic embryogenesis in Anthurium andraeanum Lind (Monocot). For the callus
formation, they were used as explants foliar segments of micropropagated plants on a
culture medium MS modified supplemented with 6,79 µM of 2,4-dichlorophenoxyacetic
acid (2,4-D) and 2,32 µM kin (kinetin). The differentiation of the somatic embryos was
achieved in the culture medium MS modified containing 4,44 µM of 6-benzylaminopurine
(6-BAP) under conditions of darkness. The germination of the somatic embryos was
obtained in the same culture medium tested supplemented with 1,78 µM 6-BAP when
placed in the sunlight growth room.
Key words: Culture medium, growth regulators, somatic embryos.
Recibido: 10 de diciembre de 2007. Aceptado: 11 de febrero de 2008.
Publicado como ARTÍCULO CIENTÍFICO en Ra Ximhai 4 (1): 135-149.
Embriogénesis somática en (Anthurium andraeanum Lind.) variedad ‘LAMBADA’ INTRODUCCIÓN
El Anthurium es el género más grande de las Araceae con 1000 especies (Croat, 1990). Especies e híbridos dentro de este género son altamente apreciados como ornamentales por sus hermosas flores y exótico follaje (Kuenhle et al., 1992). El Anthurium ha sido propagado tradicionalmente por vástagos y mediante el cultivo in Vitro de yemas axilares y callos, seguido por la formación de yemas adventicias; sin embargo este método resulta en la formación de plantas fuera de tipo (Geier, 1990; Martin et al., 2003; Puchooa, 2005). Métodos eficientes para la regeneración de plantas de células cultivadas de muchas especies importantes de cultivo fueron desarrollados durante la etapa de los años 1980 del siglo XX. Esto fue posible por la inducción de cultivos embriogénicos los cuales formaron embriones somáticos que germinaron para dar lugar a plantas normales. Esta tecnología, combinada con la habilidad de células vegetales genéticamente transformadas forman hoy las bases de la biotecnología vegetal a nivel comercial (Vasil, 2003). La embriogénesis somática es una herramienta útil para la propagación masiva y programas de transformación genética para el Anthurium (Geier, 1982; Kuenhle et al., 1992; Hamidah et al., 1997). La formación de los embriones somáticos es muy sensible a las condiciones de cultivo tales como la composición del medio de cultivo, el ambiente físico de cultivo, el genotipo y la fuente del explante (Fuentes et al., 2000). Zaidi et al., (2000) mencionan que el medio de cultivo más utilizado para la embriogénesis somática en monocotiledóneas es el MS (Murashige y Skoog, 1962) y en menor proporción el medio de cultivo NN (Nitsch y Nitsch, 1969). Sin embargo, en el género Anthurium se han empleado los dos medios de cultivo mencionados con respuestas diferentes por Pierik (1976); Geier (1986); Kuehnle et al., (1992); Atta-Alla et al., (1998) y Puchooa (2005). El objetivo de esta investigación fue lograr la inducción de la embriogénesis somática indirecta en Anthurium andraeanum Lind., variedad ‘Lambada’. Ra Ximhai Vol. 4. Número 1, enero – abril 2008, pp. 135-149. MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
La presente investigación se realizó en el laboratorio de Propagación Masiva del Instituto de Biotecnología de las Plantas perteneciente a la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, ubicado en Santa Clara, Cuba. Para iniciar los trabajos de embriogénesis somática se emplearon plántulas propagadas a través de organogénesis indirecta según la metodología propuesta por Pierik (1976). Como explantes iniciales se utilizaron hojas de plantas obtenidas in vitro de anturio variedad ‘Lambada’, a las cuales se les eliminaron los bordes y se seccionaron con un tamaño aproximado de un centímetro cuadrado y estos se colocaron con la parte adaxial hacia el El pH de los medios de cultivo fue ajustado a 5.8 antes de su esterilización y gelificados con 2.5 g.l-1 de Gelrite (Sigma, MO, EE.UU). Inducción y formación de callos
Para la inducción y formación de los callos se empleó el medio de cultivo propuesto por Murashige y Skoog (1962) (MS) modificado con una reducción de los nitratos, componentes de los macronutrientes a 50%, micronutrientes completos, vitaminas MS, mio-inositol 100 mg.l-1, tiamina 0.4 mg.l-1, sacarosa 30 g.l-1. Suplementado con cuatro concentraciones de 2,4-D (2.26; 4.52; 6.79 y 9.05 µM) combinadas con 2.32 µM de Se utilizaron diez frascos de cultivo con cinco explantes para cada tratamiento. Las condiciones de cultivo fueron de oscuridad y una temperatura de 27±2ºC. Se realizaron observaciones cada ocho días para describir los cambios y características morfológicas de los callos. A los 30 días de cultivo se evaluó el porcentaje de explantes que formaron callo. Embriogénesis somática en (Anthurium andraeanum Lind.) variedad ‘LAMBADA’ Diferenciación de los embriones somáticos
La diferenciación de los embriones somáticos se desarrolló en el medio de cultivo mencionado arriba y suplementado con tres concentraciones de 6-BAP (2.22; 4.44 y 8.88 µM) y un control sin reguladores de crecimiento. Se emplearon diez frascos de cultivo con cinco callos como explantes para cada tratamiento. Las condiciones de cultivo fueron de oscuridad y una temperatura de 27±2ºC. A los 60 días de cultivo se observó la presencia de embriogénesis somática de alta frecuencia (ESAF) y embriogénesis somática de baja frecuencia (ESBF). Las variables evaluadas fueron el número de callos con embriones somáticos, el número de embriones somáticos por callo y el número de embriones somáticos que alcanzaron la etapa Germinación de los embriones somáticos
La germinación de los embriones somáticos ocurrió en un medio de cultivo MS modificado donde se estudiaron tres concentraciones de 6-BAP (0.89, 1.78 y 2,66 µM), con una temperatura de 25±2ºC y una densidad luminosa de flujo de fotones fotosintéticos (FFF) de 100-125 µmol.m-2.s-1. Se emplearon seis embriones somáticos en etapa coleoptilar por frasco de cultivo y se utilizaron 24 frascos como repeticiones. Se efectuaron observaciones diarias para observar el inicio de la germinación y a los 30 días de cultivo se evaluó el número de embriones somáticos con germinación completa, número de embriones somáticos con germinación parcial y número de embriones somáticos con embriogénesis somática secundaria. Diseño experimental y análisis estadístico
Los experimentos fueron desarrollados con un diseño completamente al azar. A los datos obtenidos se les realizaron la comprobación de los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza. Los datos experimentales fueron analizados con un análisis de varianza simple. La comparación de medias en los tratamientos se efectuó mediante la Ra Ximhai Vol. 4. Número 1, enero – abril 2008, pp. 135-149. prueba de rangos múltiples según Tukey y Dunnett’s con una significación de 0.05, mediante el programa estadístico SPSS versión 13.0 para ‘Windows’. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Inducción y formación de callos
La formación de callos en los explantes comenzó en las zonas de corte de los segmentos foliares en todos los tratamientos evaluados. Los callos formados cubrieron la totalidad del segmento foliar a los 45 días de cultivo, donde se observó la presencia de un callo compacto, de color amarillo translúcido con características nodulares (Figura 1).
Figura 1. Callos formados a partir de segmentos foliares en Anthurium andraeanum Lind. variedad
‘Lambada’ en el medio de cultivo MS modificado a los 45 días de cultivo. El mejor tratamiento empleado para la inducción y formación de callos fue donde se utilizó una concentración de 6.79 µM de 2.4-D combinado con 2.32 µM de kinetina, en este se obtuvo el mayor porcentaje de explantes con formación de callos (Cuadro 1). Cuadro 1. Efecto de la concentración de 2,4-D en la inducción y formación de callos a
partir de segmentos foliares de Anthurium andraeanum variedad ‘Lambada’ a
los 45 días de cultivo.
Concentración de
Número de
Porcentaje de
regulador de
explantes con
explantes con
crecimiento (2,4-D)
formación de
formación de callos
Medias con letras distintas en una misma fila difieren para p< 0.05 según prueba de Dunnett’s . EE=error estándar. Embriogénesis somática en (Anthurium andraeanum Lind.) variedad ‘LAMBADA’ En cuanto al efecto del 2,4-D en la formación de callos; resultados similares fueron encontrados por Kuehnle et al., (1992) y Matsumoto y Kuehnle (1996) en híbridos de A. andraeanum, los cuales alcanzaron la inducción y formación de callos en los explantes con un rango que varió desde 4.52 a 18.1 µM de 2,4-D y 1.39 a 4.56 µM de kinetina en un medio de cultivo MS modificado. Por el contrario, en esta misma especie Kuehnle y Suggii (1991) y Puchooa (2005), indujeron una mayor formación de callos con una combinación de 0.45 µM 2,4-D y 4.44 µM de BA. Otros autores como Hamidah et al., (1997) y Geier (1986) en A. scherzerianum lograron la formación de callos (61.4%) con 6.75 µM 2,4-D combinado con 2.3 µM kinetina en un híbrido y con 0.36 µM 2,4-D suplementado con 4.4 µM BA, en un medio de cultivo Nitsch y Nitsch (1969) modificado en 18 genotipos, respectivamente. En otra monocotiledónea, como Hevea brasiliensis (Muell.) Arg., la inducción y formación óptima de callo se alcanzó en un medio de cultivo MS modificado suplementado con 9.05 µM de 2,4-D y 2.32 µM de kinetina (Kumari et al., 1999). Nakano et al., (2004) en especies del género Tricyrtis una planta ornamental, obtuvieron la mayor formación de callo con estructuras embriogénicas con 4.5 µM de 2,4-D y 0.045 µM de TDZ. En otras especies como trigo (Triticum sp.) y caña de azúcar (Saccharum officinarum L.), Zale et al., (2004) y Gandonou et al., (2005) indicaron que la habilidad en la inducción de callos está fuertemente influenciada por el genotipo. Diferenciación de los embriones somáticos
En los callos empleados como explantes y colocados en el medio de cultivo para la formación y diferenciación de los embriones somáticos, a partir de los 40 días de cultivo se observó la presencia de pequeñas estructuras de coloración amarillo transparente en los callos a los 60 días de cultivo, además en un gran número de callos se observó la presencia de ESAF y ESBF. La embriogénesis somática de alta frecuencia se caracterizó por la presencia de grupos de proembriones y también de embriones somáticos en etapa globular agrupados de color amarillo transparente; sin embargo, en la embriogénesis somática de baja frecuencia se observaron embriones somáticos aislados en diferentes etapas de Ra Ximhai Vol. 4. Número 1, enero – abril 2008, pp. 135-149. Figura 2. (A)- Callo con embriogénesis de alta frecuencia (ESAF) obtenido a partir de explantes foliares de
Anthurium andreanum con 4,44 µM de 6-BAP a los 40 días de cultivo, (B)- Callo con embriogénesis de baja frecuencia (ESBF). En cuanto al número de callos con embriones somáticos el mayor porcentaje (68,0%) se presentó en el tratamiento que contenía 4.44 µM de 6-BAP con diferencias significativas con el resto de los tratamientos. La presencia de los embriones somáticos en los callos cultivados con esta citoquinina demostró el efecto de la misma en la formación de embriones somáticos en anturio variedad ‘Lambada’ (Cuadro 2). En lo que respecta al número de embriones somáticos por callo los valores más altos se obtuvieron en un medio de cultivo con 8.88 µM de 6-BAP, con diferencias con respecto al resto de los tratamientos (Cuadro 2). A medida que se aumentó la concentración de 6-BAP se incrementó la formación de embriones somáticos por callo. Sin embargo, el mayor porcentaje (84.2%) de embriones somáticos que alcanzaron la etapa coleoptilar se logró con
Cuadro 2. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP en el desarrollo de los
embriones somáticos en medio de cultivo MS modificado en anturio (A.
andraeanum Lind.) a los 80 días de cultivo.
Concentraciones
Número de
Porcentaje
*Número de
Número de
Porcentaje de
callos con
de callos
embriones
embriones
embriones
embriones
somáticos
somáticos
somáticos en
somáticos
embriones
por callo
somáticos
coleoptilar
coleoptilar
Medias con letras diferentes en una misma columna difieren según la prueba por Tukey para p<0.05. *Medias con letras diferentes en la misma fila difieren según la prueba por Dunnett’s para p<0.05. EE= Error estándar. Embriogénesis somática en (Anthurium andraeanum Lind.) variedad ‘LAMBADA’ Con respecto a los resultados alcanzados estos difieren con los encontrados por Kuehnle et al., (1992) quiénes inducen la formación de embriones somáticos en A. andraeanum con 6.79 µM de 2,4-D combinado con 2.32 µM de kinetina y con Hamidah et al., (1997) quienes indujeron la producción de embriones somáticos con 0.46 µM de kinetina en A. scherzerianum. Sin embargo, concuerdan con Shibli y Ajlouni (2000) en black iris (Iris nigricans) una especie ornamental que con una cantidad similar 4.5 µM de BA lograron el mayor número de embriones somáticos por callo. Otros autores, como Nakano et al., (2004) en Liliaceae hallaron la formación de embriones somáticos en un medio de cultivo libre de reguladores de crecimiento. Choi et al., (1998) mencionan que el desarrollo de embriones en tejido somático se logró en ausencia de reguladores de crecimiento así como también con la presencia de otros reguladores de crecimiento. Se ha demostrado que las citoquininas son necesarias para el desarrollo de los embriones somáticos (Fujimura y Komamine, 1980; Tan et al., 2001). En caucho (Hevea brasiliensis) Kumari et al., (1999) el máximo número de embriones somáticos se desarrolló en un medio de cultivo suplementado con 3.25 µM de kinetina y 1.07 µM de ANA. Por otra parte, Vega y Prehn (2005) en Quillay y Lee y Lee (2003) en Dicentra spectabilis al suplementar el medio de cultivo con 6-BAP hallaron un incremento en la diferenciación de los embriones somáticos, demostrando el efecto de las citoquininas. En el cultivo de rosas en la variedad ‘Carefree Beauty’ y en Musa con la adición de 2.2 µM de 6-BAP al medio de cultivo se alcanzó la mayor frecuencia en la diferenciación de los embriones somáticos (Khalil et al., 2002; Li et al., 2002). George (1993) señala que las citoquininas promueven el crecimiento de los embriones preformados cuando son adicionados al medio de cultivo de formación de embriones somáticos. Germinación de los embriones somáticos
Cuando se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP en la germinación de embriones somáticos en Anthurium andraeanum Lind., se pudo observar que el mayor porcentaje de embriones somáticos con germinación completa y parcial se obtuvo en el tratamiento con 1,78 µM de 6-BAP con diferencias significativas con el resto de los Ra Ximhai Vol. 4. Número 1, enero – abril 2008, pp. 135-149. tratamientos (Cuadro 3). Los valores de esta variable disminuyeron con el incremento de las concentraciones de 6-BAP y con el control. Cuadro 3. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP en la germinación de
embriones somáticos en Anthurium andraeanum Lind., a los 60 días de cultivo.
Tratamientos
Germinación completa de los
Germinación parcial de los
embriones somáticos
embriones somáticos
No. embriones
No. embriones
somáticos/frasco
somáticos/frasco
Media Porcentaje *Rangos
Media Porcentaje
Medias con letras desiguales en una misma columna difieren según la prueba de Tukey para p<0.05. *Rangos medios con letras desiguales en una misma columna difieren según la prueba de Kruskal-Wallis para p<0.05. EE= Error estándar Los resultados alcanzados difieren con los obtenidos por Kuehnle et al., (1992) quienes con una concentración de 0.89 µM de 6-BAP lograron la germinación de embriones somáticos de híbridos de A. andraeanum. Algunos autores han señalado que la adición de 6-BAP al medio de cultivo incrementa la germinación de los embriones somáticos (Kuehnle et al., 1992; Laxmi et al., 1999; Ashok et al., 2002; Barbón et al., 2002; Li et al., 2002). Sin embargo, Mohammed et al., (2002) y Nakano et al., (2004) en estatice (Limonium bellidifolium) y lirios (Tricyrtis spp.) encontraron que los embriones somáticos en etapa cotiledonal germinaron después de dos a tres días sobre medio basal MS carente de En todos los tratamientos se observaron embriones somáticos con embriogénesis somática secundaria, pero el mayor porcentaje (53.33%) de esta variable se alcanzó cuando se le adicionó al medio de cultivo 2.66 µM de 6-BAP con diferencias significativas con el resto Embriogénesis somática en (Anthurium andraeanum Lind.) variedad ‘LAMBADA’ Tabla 4. Influencia de diferentes concentraciones de 6-BAP en el número de
embriones somáticos que desarrollaron embriogénesis somática secundaria en
Anthurium andraeanum variedad ‘Lambada’ a los 60 días de cultivo.
Tratamientos
Embriones somáticos con embriogénesis secundaria
No. de ES por frasco
Rangos medios
Porcentaje
Rangos medios con letras distintas en una misma columna difieren según prueba de Kruskal-Wallis para p<0.05. Ravishankar y McComb (2006) encontraron en sándalo (Santalum album L.) que la producción de embriones somáticos secundarios a partir de los embriones primarios ocurrió cuando los embriones somáticos se mantuvieron por períodos largos de tiempo sobre medios de cultivo de inducción con 6-BAP o TDZ. La formación de embriogénesis secundaria es una de las causas de la asincronía durante la embriogénesis somática, los embriones somáticos pueden formarse a partir del eje principal del embrión (Gavich et al., 1992) y esto es debido a que existe una inducción de la división de las células embriogénicas que quedan latentes en las paredes del embrión (Nomura y Komamine, De los resultados presentados en este estudio permiten concluir que la combinación de 6.79 µM de 2,4-D y 2.32 µM de kinetina en un medio de cultivo MS modificado fue donde se alcanzaron el mayor número de explantes con formación de callos. La diferenciación de los embriones somáticos se logró en el mismo medio de cultivo suplementado con 4.44 µM de 6-BAP. Por último la germinación de los embriones somáticos se obtuvo con una AGRADECIMIENTOS
Nuestro agradecimiento a la Asociación Nacional de Universidades e Instituciones de Educación Superior (ANUIES) y al Colegio de Postgraduados Campus Tabasco por la beca y el apoyo otorgado para la realización de esta investigación y los estudios de Doctorado. Ra Ximhai Vol. 4. Número 1, enero – abril 2008, pp. 135-149. LITERATURA CITADA
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Embriogénesis somática en (Anthurium andraeanum Lind.) variedad ‘LAMBADA’ Zaidi, N., Habib, N. K., Zafar, F. y Zafar, S. 2000. Bulbous and cormous
monocotyledonous ornamental plants in vitro. Quarterly Science Vision 6(1):58-
Zale, J. M., Borchardt-Wier, H., Kidwell, K. K. y Steber, C. M. 2004. Callus induction
and plant regeneration from mature embryos of a diverse set of wheat
genotypes. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76:277-281.
Nydia del Rivero Bautista
Bióloga por el Colegio de Postgraduados Campus-Tabasco.

Daniel Agramonte Peñalver
Doctor en Ciencias en Universidad Central Marta Abreu de las Villas, Instituto de
Biotecnología de las Plantas, Santa Clara, Cuba. Maestro en Ciencias en Biotecnología
Vegetal, Instituto de Biotecnología Vegetal. Santa Clara, Cuba. Licenciatura en la
Universidad Central Marta Abreu de las Villas, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Santa
Clara Cuba. Profesor Investigador del Instituto de Biotecnología de las Plantas desde 1994.
Director del Institución de Biotecnología de las Plantas desde 2002.

Raúl Barbón Rodríguez
Doctor y Profesor Investigador Titular por el Instituto de Biotecnología de las Plantas de la
Universidad Central de Marta Abreu de las Villas, Facultad de Ciencias Agropecuarias.
Santa Clara Cuba.

Wilder Camacho Chiu
Doctor en Ciencias Agrícolas, Universidad Autónoma de Nuevo León, México. Maestro en
Ciencias en Suelos Tropicales. Ingeniero Agrónomo, Colegio Superior de Agricultura
Tropical, México. Correo electrónico: [email protected]
Raúl Collado López
Maestro por Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Marta Abreu”
de Las Villas.
Felipe Jiménez Ferry
Profesor Investigador por el Instituto de Biotecnología de las Plantas de la Universidad
Central de Marta Abreu de las Villas, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Santa Clara
Cuba.
Ra Ximhai Vol. 4. Número 1, enero – abril 2008, pp. 135-149. Marta Pérez Peralta
Biotecnología Vegetal por el Instituto de Biotecnología de las Plantas de la Universidad
Central de Marta Abreu de las Villas, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Santa Clara
Cuba.

Odalys Gutiérrez Martínez
Profesor Investigador por el Instituto de Biotecnología de las Plantas de la Universidad
Central de Marta Abreu de las Villas, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Santa Clara
Cuba.

Source: http://www.uaim.edu.mx/webraximhai/Ej-10articulosPDF/Art%5B1%5D%208%20Embriogenesis.pdf